Il ciclo dell’azoto
Introduzione
Il ciclo dell’ azoto costituisce uno dei pilastri fondamentali nel bagaglio delle conoscenze dell’ acquariofilo. Esso è alla base del buon funzionamento di un acquario e condiziona fortemente la sua riuscita o il suo fallimento. Attraverso il ciclo azotato si trasformano sostanze tossiche come l’ ammoniaca (NH₃) ed i nitriti (NO₂⁻) in altre meno tossiche come i nitrati (NO₃⁻) o inerti come l’ azoto gassoso (N₂).
Un ciclo non efficiente potrebbe portare alla morte i pesci, le lumache ed i gamberetti e spesso rappresentare la causa scatenante di infiorescenze algali, soprattutto di alghe filamentose stimolate dalla presenza di ioni ammonio (NH₄⁻)
Conosciamo l’azoto
Prima di entrare nel vivo dell’ argomento è doveroso dare qualche informazione su di esso. L’ azoto nella sua forma molecolare N2 costituisce circa l’ 80% della composizione dell’ aria.
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Questa molecola è così stabile grazie alla forza esercitata dai tre legami (N☰N) che uniscono i due atomi di azoto da sembrare quasi un gas
nobile come l’ Elio (He), il Neon (Ne), l’ Argo (Ar), il Kripto (Kr), o lo Xeno (Xe) in termini di reattività. L’ azoto presenta diversi stati di valenza che gli consentono di formare molti composti inorganici con diversi atomi come l’idrogeno, l’ ossigeno, il carbonio, la famiglia degli alogeni, il fosforo, lo zolfo etc. La lista dei composti diventa ancora più lunga se pensiamo ai composti organici dove l’ azoto è legato al carbonio, all’ idrogeno e all’ ossigeno. Nelle sue numerose combinazioni con altri atomi lo troviamo quasi sempre nella forma trivalente e pentavalente. Avendo un’ energia di attivazione molto alta in natura esso si combina con gli altri elementi solo se viene somministrata dall’ esterno un’ energia molto elevata generalmente sotto forma di calore come la scarica di un fulmine o da luce ad alta energia.
I prodotti azotati formatisi a seguito di una scarica elettrica come per es. il biossido di azoto arrivano nel terreno attraverso le piogge acide con formazione nel suolo di NO₃⁻ e (NH₄)₂CO₃. I composti azotati vengono prodotti anche direttamente nel terreno attraverso processi come l’ azotofissazione. Questo processo è operato da batteri simbiontici (p. es il Rizhobium) che penetrano all’ interno delle radici delle leguminose o del trifoglio formando dei noduli radicali entro cui immagazzinano l’ azoto atmosferico successivamente trasformato in NH₃ oppure da batteri liberi (Clostridium, Azotobacter, Rodobacter e il temuto cianobatterio).
La seguente reazione biochimica di trasformazione di N₂ in NH₃ : N₂ + 8e⁻+ 8H⁺+ 16MgATP → 2NH₃ + H₂ + 16MgADP + 16Pi è catalizzata da un complesso proteico chiamato complesso della nitrogenasi attraverso l’ energia fornita da ATP.
MgATP (sale di magnesio di adenosina trifosfato) fornisce alla cellula l’ energia necessaria per la reazione attraverso la rottura di un legame fosfato altamente energetico con formazione di MgADP (sale di magnesio di adenosina difosfato). Altri prodotti della reazione sono l’ H₂ ed i fosfati inorganici (Pi).
L'importanza dell'azoto per le piante
L’azoto sotto forma dei suoi sali inorganici (NH₄⁺, NO₃⁻) e/o dell’ urea (composto organico) costituisce un elemento indispensabile per le piante, esso infatti rientra tra i macroelementi nutritivi che come il potassio ed il fosforo non può mancare. L’ azoto è presente in molte molecole organiche a partire dai semplici aminoacidi di cui alcuni definiti essenziali perché prodotti dalle piante attraverso complesse reazioni biochimiche e a loro volta questi vengono utilizzati per la sintesi di strutture più complesse come le proteine. I processi biochimici dove l’ azoto è presente sono tantissimi e giocano un ruolo fondamentale nella vita degli esseri viventi.
Il ciclo dell'azoto
L’ azoto atmosferico viene assorbito continuamente dal mondo vegetale grazie ai batteri ed impiegato dalle piante per sintetizzare amminoacidi e forme più complesse come le proteine. Attraverso la catena alimentare questi composti organici azotati passano agli animali ma nonostante ciò la sua quantità percentuale nell’ aria resta praticamente invariata. Questo è dovuto al ciclo dell’ azoto che attraverso varie fasi di degradazione e trasformazione dell’ azoto organico in quello inorganico si chiude con la trasformazione finale dei composti azotati inorganici in N₂ (azoto gassoso) che ritorna ad alimentare e quindi a mantenere costante la percentuale dell’ azoto in atmosfera.
Il ciclo dell'azoto in acquario
E’ opportuno fare una premessa che vale non solo per il ciclo dell’azoto ma per tutto ciò che si viene a formare all’ interno di un acquario o che introduciamo dentro di esso.
La vasca è un parallelepipedo nella sua forma usuale formato da 5 lastre di vetro chiuse da un coperchio o lasciata aperta. Questo significa che tutto quello che si forma al suo interno li resta e nel tempo tenderà ad accumularsi a meno che non venga trasformato in altre sostanze che
tenderanno anch’ esse ad accumularsi. Questo è vero per i composti azotati ma anche per i composti del carbonio (esiste anche un ciclo del carbonio altrettanto importante) piuttosto che per i sali di fosfati (anch’ essi hanno un loro ciclo). Alcuni di questi prodotti di trasformazione accumulandosi possono col tempo creare problemi, altri i problemi li creano in tempi brevi come succede per i composti azotati. A tal proposito è sufficiente pensare alla tossicità esercitata dai nitriti che non dovrebbero essere rilevati dai test specifici e che già al dosaggio di 0,5 ppm possono iniziare a creare problemi di tossicità verso i pesci.
Riprendiamo il ciclo dell’ azoto già descritto prima calandolo nella realtà del nostro acquario con qualche tip (consiglio)
Quando facciamo lo start up di un acquario, che esso sia completo di tutto (fondo, arredo, piante) o che sia stato realizzato solo il layout, inevitabilmente si dissolveranno in acqua alcuni sali e del materiale organico introdotti con l’ arredo. Poichè non ci troviamo in un ambiente sterile la carica batterica presente sul layout inizierà a sfruttare quello che involontariamente gli mettiamo a disposizione.
La loro crescita sarà condizionata dalla presenza di sostanze organiche, dalla temperatura e dal valore del pH. Chi si interessa di microbiologia sa bene che per sviluppare colonie batteriche bisogna “inseminare” la colonia su un terreno ricco di sostanze nutritive e che abbia caratteristiche acide o basiche a secondo dei batteri che si vogliono far sviluppare (parliamo di colture selettive) e tenere la coltura ad una temperatura di circa 37°C.
Ma quali sono i batteri che si sviluppano in un acquario ?
I primi a svilupparsi sono i batteri eterotrofi, quelli che non sono in grado di produrre tutto ciò che a loro serve per vivere e quindi necessitano di
assumerlo dall’ esterno. Questi batteri nutrendosi del materiale proteico, di carboidrati e degli acidi grassi disponibili trasformano attraverso complesse reazioni cataboliche le proteine in unità più semplici, i peptidi, e successivamente in amminoacidi. Questi ultimi saranno poi trasformati in NH₃ .
Proteine →Peptidi →Amminoacidi →NH3/NH4+ (a secondo del pH dell’ambiente)
Questa prima parte del ciclo viene chiamata ammonificazione.
TIP: per facilitare lo sviluppo di questi batteri nello start up di una vasca solo con layout è utile tenere il pH ad un valore leggermente alcalino (tra 7.0 e 7.5), una temperatura intorno ai 28 °C e immettere in vasca un piccolissimo pizzico di mangime come fonte di proteine e di acidi grassi. Molti suggeriscono l’ utilizzo di batteri dormienti che alla fine non portano ad un grosso guadagno temporale ma nulla ne vieta il loro utilizzo.
Condizioni ambientali diverse come un pH leggermente acido non impediscono lo sviluppo delle colonie ma ne possono rallentare la crescita e quindi i tempi di maturazione del filtro biologico e della vasca.
Chi parte con un layout completo di piante non ha la necessità d’ inserire lo starter che esso sia il pizzico di cibo piuttosto che quello batterico.
Il passaggio successivo all’ ammonificazione è la nitrificazione.
Questa avviene in due step operati da un altra categoria di batteri detti autotrofi. Questi batteri sfruttano fonti energetiche diverse. Ci sono quelli che sfruttano la luce (b. fotoautotrofi come i cianobatteri) attraverso la fotosintesi e quelli che sfruttano l’energia chimica (chemoautotrofi) ricavata attraverso l’ ossidazione dell’ N in NH₃.
I batteri chemolitoautotrofi sono quelli che ci interessano. Essi hanno bisogno della CO₂ come fonte di carbonio per la biosintesi (questo aspetto ci fa capire perchè il ciclo del carbonio è altrettanto importante quanto quello dell’ azoto poiché senza di esso non c’è biosintesi). Attraverso la respirazione cellulare che comporta l’ ossidazione di NH₃ in NO₂⁻ e poi in NO₃⁻ questi batteri traggono l’ energia necessaria per ottenere a seguito della CO₂ assorbita la sintesi di glucosio tramite il ciclo di Calvin. Fanno parte a questa categoria i batteri Nitrosomonas, Nitrobacter e
Nitrospira.
Il primo step riguarda la trasformazione di NH₃ in NO₂⁻ operata dai b. Nitrosomonas, successivamente la trasformazione di NO₂⁻ in NO₃⁻
è operata dai Nitrobacter e dai b. Nitrospira. Questi ultimi sono di particolare importanza perchè capaci di catalizzare da soli anche
entrambi i processi di nitrificazione e per questo vengono definiti “ossidanti completi dell’ ammoniaca” o organismi “commamox”.
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Questo è l’ intero processo che guida dal punto di vista biochimico la trasformazione dell’ ammoniaca in nitriti e questi ultimi in nitrati.
La reazione è complessa per chi è a digiuno di biochimica ma possiamo semplificarla nel seguente modo:
NH₃ + O₂ -> NH₂OH + H₂O -> NO₂⁻ + 5H⁺ + 4e⁻ 1° step
NO₂⁻ + H₂O -> NO₃⁻ + 2H⁺ + 2e⁻ 2° step
L’ azoto ammoniacale passa da uno stato di ossidazione-3 a-1 nella idrossilammina (un idrogeno è stato sostituito da un ossidrile) per poi arrivare ad uno stato di ossidazione +3 nel nitrito. La reazione completa rilascia idrogenioni che esprimono la capacità anche se pur piccola di questi batteri presenti nel filtro ed in vasca a dare il loro contributo acidificante durante il processo di nitrificazione mentre gli elettroni fluiscono verso l’ ossigeno attraverso la catena respiratoria.
Ad inizio decennio u.s. uno studio ha dimostrato il ruolo degli archeobatteri quali responsabili principali del processo di nitrificazione. Lo studio è nato dall’ osservazione che questi processi si registravano anche quando non veniva rilevata la presenza di nitrosomonas nel filtro.
Le colonie batteriche non si formano tutte nello stesso tempo. Inizialmente sono i Nitrosomonas a colonizzare i supporti biologici e solo in seguito abbiamo quelle da Nitrobacter.
TIP: La velocità di colonizzazione da parte di batteri nitrificanti è condizionata da tre fattori: presenza di materiale proteico, temperatura e valore del pH già trattati nell’ articolo.
L’ uso di attivatori batterici non porta ad un grosso vantaggio temporale dal punto di vista della maturazione biologica. Fare uno start up con
piante comprese quelle a crescita rapida aiuta a tenere bassa la concentrazione di ioni ammonio. Le piante lo assimilano con più facilità rispetto ai nitrati ma anche le alghe sono fortemente competitive nell’ assorbimento di questo composto azotato, soprattutto le filamentose. Non è casuale che queste sono le prime a comparire specialmente negli acquari “giovani”. La maturazione di un filtro avviene mediamente entro un mese, a volte anche prima, ma è preferibile lasciar passare i 30 giorni per avere un filtro ben maturo e pronto ad assorbire l’ aumento improvviso del carico
organico sequenziale all’ inserimento dei pesci e alla loro alimentazione.
La maturazione dell’ acquario richiede tempi molto più lunghi che possono arrivare anche a superare i sei mesi. Per chi preferisce fare uno start up senza piante è bene lasciare l’ acquario con le luci completamente spente sino alla piantumazione per evitare lo sviluppo di alghe. A partire dalla seconda settimana dall’avvio è utile fare i test di NO₂⁻ e NO₃⁻ settimanalmente per valutare l’ aumento dei NO₂⁻ che presenteranno un picco seguito da un suo successivo decadimento dovuto alla formazione dei NO₃⁻. Non sempre l’ aumento dei NO₃⁻ è rilevabile soprattutto in presenza di una ricca piantumazione ancor più se fatta con piante a rapida crescita. I NO₂⁻ non devono essere più rilevati dai test prima d’inserire i pesci in vasca.
TIP: la gatta per fare presto fece i figli ciechi. Soprattutto negli acquariofili neofiti succede che per bruciare le tappe o per cattivo consiglio “metti questa fialetta di batteri” s’ introducono i pesci anche dopo una settimana dall’ avvio. Il tempo breve di maturazione del filtro, incapace a catabolizzare il carico organico, porta alla loro morte. Le cause possono essere legate alla concentrazione di ammoniaca (particolarmente tossica già a valori > di 0,1 ppm) e facilitate da un pH basico (> 8.0) oppure da un eccesso di nitriti perché non è ancora maturata la crescita delle colonie che trasformano i nitriti in nitrati.
La tossicità dei nitriti è dovuta alla formazione di metaemoglobina che impedisce il normale scambio CO₂/O₂ a livello branchiale portando i pesci ad asfissia. Il primo effetto visibile è la tendenza dei pesci che boccheggiano e nuotano subito sotto la superficie dell’ acqua per assorbire l’ossigeno atmosferico.
Il grafico mostra l’ andamento delle concentrazioni di NH3/NH4+ al variare del pH.
Per un pH superiore a 7.0 le concentrazioni dello ione ammonio cominciano a ridursi a favore di quelle di NH3.
Quando il pH = pKa la reazione NH4+ H2O = NH3 + H3O+ è all’equilibrio e quindi le concentrazioni delle due specie sono al 50%.
Tale situazione la ritroviamo quando il pH raggiunge il valore di 9,26. Per un pH superiore a 8.0 la percentuale di formazione di ammoniaca mette a rischio la vita degli animali qualora il processo della nitrificazione non sia efficace.
Abbiamo finito ? NO … il ciclo non si è chiuso.
Come tutto ciò che è assimilabile ad un ciclo anche quello dell’azoto si chiude con la denitrificazione dei NO₃⁻ ad N₂. L’ azoto ritorna da dove è venuto … in atmosfera.
I principali batteri che operano la denitrificazione sono batteri anaerobici (Bacillus, Micrococcus, Pseudomonas, Spirillum) e tra questi il genere Pseudomonas aeruginosa è in grado di denitrificare quasi il 50% dei nitrati presenti.
Chimica
La trasformazione dei nitrati in azoto gassoso richiede diversi passaggi operati da diversi enzimi appartenenti alla famiglia delle reduttasi ; la reazione complessiva di trasformazione la possiamo riassumere in questo unico passaggio:
2 NO3 − + 10 e− + 12 H+ → N2+ 6 H2O
A differenza della nitrificazione che richiede un ambiente aerobico questa reazione procede in ambienti anossici dove la presenza di ossigeno è estremamente ridotta o nulla e quindi saranno i NO₃⁻ ed i successi composti azotati di trasformazione (NO₂⁻, NO ed N₂O) ad essere usati come accettori terminali di elettroni. I donatori di elettroni sono le ossidoreduttasi, particolari enzimi che catalizzano le reazioni biochimiche.
La denitrificazione che chiude il ciclo del N non è semplice ad ottenersi in un acquario ed è per questo che normalmente la descrizione del ciclo dell’ azoto termina con la formazione dei nitrati in parte assorbiti dalle piante ed in parte ridotti attraverso cambi parziali.
Naturalmente si possono verificare delle zone anossiche negli strati più profondi di fondi compatti o di fondi permeabili ma di spessore alto che impediscono o rallentano di molto il passaggio dell’ acqua apportatrice di ossigeno. In queste zone o sacche anossiche i batteri anaerobici trasformano i nitrati in azoto gassoso che lentamente si libera dal fondo. Quanti di voi hanno avuto modo di vedere improvvisamente delle bollicine che si staccano dalla superficie del fondo per risalire lungo la colonna d’ acqua ?
TIP: Quando osserviamo la risalita di bolle di gas dal fondo non è detto che sia necessariamente N2 prodotto dalla denitrificazione anaerobica. Nei fondi molto sporchi l’ accumulo di materiale organico comprendente anche composti solforati libera , a seguito dell’ attività di particolari batteri anaerobici (Sulfobacteria e Clostridium) definiti solfo-riduttori, acido solfidrico (H₂S) dal caratteristico odore di uova marce. L’ acido solfidrico è dotato di particolare tossicità che si può manifestare attraverso una semplice irritazione per concentrazioni basse sino ad arrivare a collasso e morte per paralisi dei centri nervosi quando raggiungono concentrazioni elevate.
Quindi quando vedete salire dal fondo delle bollicine alzate il coperchio del vostro acquario ed usate il vostro naso come un detector per scoprire se questo gas è inodore (N₂) oppure puzza di uova marce (H₂S). Sifonare sistematicamente il fondo sfiorando la superficie in occasione della manutenzione ordinaria di un acquario ritarderà di molto l’ accumulo di detriti organici nel sottofondo.
Bibliografia
– Nitrogen Cycle – Purificación Cabello – Encyclopedia of Microbiology (Fourth Edition), 2019
– Environmental Biotechnology and Safety- M. Ruscalleda Beylier – Comprehensive Biotechnology (Second Edition), 2011
– Nitrospira – Holger Daims, Michael Wagner – Trends in Microbiology, May 20©18, Pages 462-463
– Laura A. Sauder, Katja Engel et al. – Aquarium Nitrification Revisited: Thaumarchaeota Are the Dominant Ammonia Oxidizers in Freshwater Aquarium Biofilters – Journal Plos One, August 2011
– W G Zumft – Cell biology and molecular basis of denitrification Microbiol Mol Biol Rev. 1997 Dec; 61(4): 533–616
Photo credit web
https://alevelbiology.co.uk/notes/nitrogen-cycle/
Maurizio Vendramini – Zio pesce blog
Science Direct – Nitrogen cycle
Julio Cesar Bastos Fernandes – Researchgate.net
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